自噬在男性勃起功能障碍中的研究进展

关键词：勃起功能障碍；自噬；mTOR 

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED），表现为各种原因导致的阴茎无法达到和（或）维持相应的勃起硬度以达到令人满意的性生活1。因为地区环境、社会观念、医疗水平等因素的影响，不同国家ED的患病率有很大区别，我国ED的患病率达到12%，相关研究机构预测，ED患病人数将逐年增加，预计到2025年，全球各种因素导致的ED患者的总人数将达到3.22亿2。越来越多的人开始关注并研究男性健康问题。针对ED发病机制的深入研究，使我们大致了解了生理性阴茎勃起过程是一种在多重神经调节下的复杂血管状态改变，该过程需要解剖、神经系统、内分泌系统、心血管系统和心理等方方面面的密切协同作用，同时被各种药物、营养状况及全身疾病等影响3，上述任何因素的改变都可以诱发ED。

自噬是一种应对缺氧、缺糖和外界压力等特殊应激，维持胞内稳态的“自食”机制，对维持脂肪、氨基酸、碳水化合物和核苷酸的胞内供应至关重要。它作为一种真核细胞蛋白降解的方法，通过双层膜的囊泡包裹细胞质内的成分（细胞器、蛋白等），形成自噬体，进而传递到溶酶体中进行降解的过程4，对维持细胞组织的正常生理功能起着十分关键的作用，在机体的炎症、心血管、免疫、肿瘤、神经退行性等疾病的发生发展过程中具有十分重要的作用。近年来，为进一步探索ED的发病机制、寻找治疗ED的新靶点，自噬在ED的研究中逐渐受到重视，越来越多的学者开始关注勃起功能障碍中的自噬现象，现对其作如下综述。

1、细胞自噬

1.1、细胞自噬的分类

自噬是将细胞质内物质运输到动物细胞的溶酶体中或植物和酵母细胞的液泡中所有通路的通称。大致可以分为三类：巨自噬，微自噬，和分子伴侣介导的自噬。

巨自噬需要借助中间细胞器“自噬体”。隔离膜（也称为吞噬细胞）隔离一小部分包括可溶性物质和细胞器在内的细胞质形成自噬体。自噬体与细胞溶酶体融合形成自噬溶酶体并降解包含在其中的物质。自噬体也可能在与溶酶体融合之前与胞内体相融合。5

在微自噬中，溶酶体直接通过内陷来包裹细胞质膜的一部分，物质的降解发生于溶酶体，整个过程未形成自噬体。微自噬期间的膜动力学可能与发生在晚期内体中的内体排序运输复合物（ESCRT）依赖性多囊泡体（MVB）的形成非常相似，（这句话不通）MVB形成期间胞质蛋白会有选择性地大量掺进内体腔。6（Sahu等，2011）（去掉）。

第三类自噬是分子伴侣介导的自噬。分子伴侣介导的自噬过程不涉及膜重组，相反，底物蛋白质结合分子伴侣后直接转移进入到溶酶体内。伴侣蛋白Hsc70（热休克同源70）和协同伴侣特异性识别含有KFERQ样五肽的细胞溶质蛋白（Orenstein和Cuervo，2010）。跨膜蛋白Lamp-2A作为溶酶体上的受体发挥作用，并折叠的蛋白质通过多聚体转移复合体输送到溶酶体腔内。分子伴侣介导的自噬底物是可溶蛋白分子，并有特性性受体（这种表达对吗），因此此降解途径在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性。巨自噬被认为是自噬的主要类型，与微自噬和分子伴侣介导的自噬相比，它的研究最为广泛。因此，在此我们将巨自噬简称为“自噬”。7,8

根据分解物质的不同，自噬又可分为选择性自噬（selective autopahgy）和非选择性自噬（non- selective autophagy）9。选择性自噬为细胞特异包裹一些物质进行分解，其中包括 Cvt 途径（the cytoplasm to vacuole targeting pathway）10、过氧化物酶体自噬（pexophagy ）11 、线粒体自噬（mitophagy）12。与其他自噬途径不同，Cvt 途径是一种细胞内合成途径，它主要通过 Cvt 囊泡（Cvt vacuole）包裹两种液泡水解酶的前体（PrApel 和PrAmsl），Cvt 泡运送至液泡并与液泡融合，通过切割这两种前体形成 Apel 和 Amsl；过氧化物酶体自噬和线粒体自噬指自噬泡特异包裹过氧化物酶体和线粒体进行降解。非选择性自噬随机包裹细胞质内的需要降解的物质9。值得注意的是，选择性自噬几乎不会包裹细胞质，选择性自噬的自噬泡也比非选择性自噬的自噬泡要小，Cvt 途径的 Cvt 泡的直径一般在 150 nm 左右，而非选择性自噬的自噬泡直径约 300～900 nm13。

1.2、细胞自噬的过程

真核细胞的自噬通路主要包括了几个阶段，自噬诱导，自噬小泡成核，自噬体膜的延伸和再生，以及自噬小体和溶酶体的融合4。

第一阶段：自噬诱导信号被细胞接受后．类“脂质体”碗状结构即在胞浆某处形成小的膜结构，在电镜下观察到其不断扩张、呈非球形、扁平状双层膜的碗状结构，称为自噬前体(phagophore)，这种结构的电镜观察结果是指示自噬发生的金标准之一。

第二阶段：不断延伸的自噬前体，将胞浆中的若干成分(包括细胞器)收口包人，成为密闭的球状自噬体(autophagosome)。自噬体的电镜观察结果是指示自噬发生的金标准之一。自噬体的特征有两个：双层膜，内含诸如线粒体、内质网碎片等胞浆成分。

第三阶段：自噬体形成后，可能与细胞内吞的吞噬泡(phagocytic vacuole)、吞饮泡(pinosome)和内体(endosome)融合(此阶段为非必需步骤)。

第四阶段：自噬体与溶酶体(1ysosome)发生融合，形成自噬溶酶体(autolysosome)。期间溶酶体酶降解自噬体的内膜．使两者的内容物合为一体，自噬体巾的包含物被降解．将产物诸如氨基酸、脂肪酸之类输送到胞浆中．重新利用供能．残渣则被排出细胞外或滞留于胞浆4。

1.3、自噬的调控信号通路

1.3.1 ATG

自噬过程高度保守，主要由 ATG 调控，目前在酵母中发现了 30 余种。根据参与自噬过程的不同，可以分为 6 组：（1）ATG1 激酶复合体（ATG1-13-17-29-31）；（2）ATG-9；（3）Ⅲ 型磷脂酰肌醇 3- 激酶（PI3K ）复合体（ATG6-ATG14-Vps15-Vps34）；（4）3-磷脂酰肌醇结合 ATG1-ATG18 复合体；（5）ATG12 泛素样蛋白结合系统（ATG12-ATG5-ATG16）；（6）ATG-8泛素样蛋白结合系统14。Beclin-1（ATG-6）最早被发现，可促进自噬的发生发展，是自噬过程中重要的调控因子，而 LC3 （ATG-8）的含量与自噬泡的数量成正比，因此，二者均为最常用的自噬标志物。Bcl-2家族蛋白与Beclin 1之间的相互作用可以介导自噬和细胞凋亡之间的相互作用。 Beclin 1和抗凋亡蛋白Bcl-x（L）之间的相互作用由BH3-only蛋白修饰15，16。

1.3.2哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）

mTOR是目前研究较多的自噬信号，mTOR 是调控自噬的关键酶，调节细胞生长、代谢和 ATP 的产生及应激。mTOR 以两种形式存在：mTORC1 和 mTORC2。前者主要在细胞生长、凋亡和自噬中发挥作用17，后者调控细胞骨架蛋白的构建和存活，mTORC1 可被雷帕霉素阻断，并调节细胞自噬；而 mTORC2 对雷帕霉素不敏感，不直接调节自噬18。酵母及哺乳动物相关研究表明，雷帕霉素可明显提高自噬活性19。身为 PI3K相关激酶（PIKK）家族成员的 mTOR 是一种进化上较为保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其活性为自噬体形成、成熟的关键。一般认为，mTOR 是调节细胞生长、增殖和自噬等上游信号转导通路的聚集点20。mTOR 在人类中的同源基因是FRAP1（FK506 binding protein rapamycin associated protein 1）21，可接受多种信号，如 Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK， mTOR 信号途径的调控同自噬的活性以及细胞外的营养状况是密切相关的，可感受营养和能量的变化。

1.3.3磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP activated proteinkinase，AMPK）：

AMPK 是细胞内高度保守的另一个感受器，可在细胞 AMP/ATP 高比例下被激活，也是参与维持细胞能量稳态的重要介质。AMPK 通过磷酸化TSC1/2 复合体抑制mTOR 激酶活性，激活自噬22。Papandreou 等23研究证明， AMPK 对 mTOR 活性的抑制参与低氧诱导自噬的激活。另有研究认为24，AMPK 激动剂 AICAR 在哺乳动物细胞内尽管抑制了自噬活性，但这并非与AMPK 的激活直接相关。

1.3.4 PI3K 通路酪氨酸激酶受体（tyrosine kinase receptor，RTK）

RTK作为膜受体，在细胞表面感受上游生长因子等信号后可引起自身磷酸化激活。RTK 激活下游 PI3K 通路，在细胞膜上生成第二信使磷酸酰肌醇 3 磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate， PIP3），PIP3 使细胞内含有 PH 结构域的信号蛋白Akt 与磷酸肌醇蛋白激酶 1 （phosphoinositide dependent kinase-1，PDK-1）结合，PDK-1 使 Akt磷酸化激活。PI3K-Akt 通路被激活后通过抑制TSC1/2 复合体激活 mTOR 激酶，抑制自噬25。PI3K可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型 PI3K 可抑制细胞自噬，研究发现，沙地蟾蜍素可通过抑制Ⅰ型 PI3K诱导细胞死亡26。Ⅱ型 PI3K 与自噬关系不大；Ⅲ 型 PI3K 可激活细胞自噬。目前研究较广的是Ⅰ型PI3K26,27。

1.3.5 p53 通路：p53 是一种重要的抑癌基因，在营养缺乏或细胞毒性等刺激下，p53 被磷酸化， AMPK 被激活后抑制 mTOR，可引起及调节自噬。另一方面，p53 结合于细胞死亡基因（damage regulated autophagy modulator，DRAM）的启动子激活 DRAM，DRAM 能够编码一种诱导细胞死亡吞噬的溶酶体蛋白，引起自噬28。

2.自噬参与男性勃起功能障碍发生中的机制

阴茎的勃起过程是一个十分复杂的过程，需要在神经系统、内分泌系统等各组织的精密配合下才能完成，其中任何一部分出现问题都可以导致阴茎勃起困难。随着研究方法和技术的不断革新，我们也渐渐解开了ED发病机制的小部分秘密，一系列细胞因子及信号通路都参与其中，目前主要包括三个方面，海绵体平滑肌舒张通路，即NO/cGMP信号通路，cAMP信号通路，CO信号通路和H2S信号通路29,30，海绵体平滑肌收缩通路即RhoA/ROCK信号通路和Raf/MEK/ERK1/2信号通路31,32。神经信号通路，即调控催产素能神经元来释放催产素33。而针对自噬在不同的病理条件诱导的ED模型中的有关研究才刚刚开始。

2.1自噬参与年龄相关性ED发生的机制研究

随着人口老龄化男性人数的增加，老年ED患者的数量正在逐年增加。 衰老通常被认为是ED的高危因素，严重影响老年男性的生活质量34。随着衰老，自噬相关酶的活性和溶酶体的形态在几乎所有组织中都发生变化。最近，在线虫中发现了自噬和长寿的相关性，为自噬和长寿之间的关系提供了相应的遗传证据35。许多细胞中也观察到自噬体的年龄相关变化，包括心肌细胞，骨骼肌细胞和其他长寿细胞36。有研究还报道细胞自噬活动随着衰老而降低，这可能与年龄相关的疾病如ED等有关37。Zhang等38在研究中发现，同对照组相比，老年ED大鼠的CSMC中端锚聚合酶1和自噬减少，这与年龄相关ED中CSMC的丢失一致。老年ED大鼠的CSMC自噬体数量明显减少，LC3-I / II和Beclin 1表达下调，p-p70S6K（Thr389）含量增加，提示在老年ED大鼠中海绵体平滑肌组织中细胞自噬水平是降低的。在给予端锚聚合酶之后，大鼠CSMCs细胞生存时间延长，细胞数量增多，同时细胞中自噬体数量明显增加，LC3-I / II和Beclin 1，p-p70S6K（Thr389）变化得到逆转，提示细胞自噬水平和mTOR信号通路均得到增强。由此可见端锚聚合酶1可通过增强自噬和调节mTOR信号传导途径对细胞增殖起到积极作用，从而改善勃起功能。Tang等39发现人组织激肽释放酶1（hKLK1）可以通过增强细胞自噬改善老年大鼠的勃起功能。与青年野生鼠和老龄转基因鼠组相比，老龄野生型大鼠平滑肌/胶原比率降低，自噬体较少，Beclin 1和LC3-II表达较低，表明平滑肌功能受损，平滑肌细胞自噬水平较低。PI3K / Akt / mTOR信号通路作为自噬的负调节因子，在老龄野生型大鼠中表达上调。hKLK1可通过抑制PI3K / Akt / mTOR途径上调保护性自噬，从而部分恢复老龄转基因大鼠的勃起功能，由此可见调节mTOR通路增加自噬水平为我们提供一种治疗年龄相关性ED可能的途径，但是其中的具体机制还有待深入研究。

2.2自噬参与性腺功能低下诱导ED发生的机制研究

睾酮是阴茎正常勃起的一个重要因素，任何导致血睾酮水平降低的疾患几乎不可避免地使阴茎勃起功能受损。低雄激素水平是导致ED发生的一个重要危险因素。Wang等40通过手术切除双侧睾丸的方法建立性腺功能低下大鼠ED模型，发现在去势大鼠的阴茎海绵体中自噬体减少，Beclin1和LC3-II的表达降低，同时细胞凋亡指数升高，Bcl-2 / Bax比值降低。补充睾酮后大鼠阴茎海绵体中自噬水平增加，相应凋亡水平得到抑制，部分改善大鼠勃功能。Zhang等41通过给予老年大鼠长期服用5α还原酶抑制剂发现，大鼠体内睾酮水平减低，勃起功能受损，阴茎海绵体平滑肌减少，内皮细胞一氧化氮合酶和LC3-II蛋白表达降低，自噬体减少，细胞凋亡增加。根据以上研究结果，我们认为在雄激素缺乏患者体内，低雄激素状态可能通过Beclin1与Bcl-2信号途径导致阴茎海绵体组织中的自噬水平降低，凋亡增加，影响勃起组织的结构和功能完整性，导致ED的发生。

2.3自噬参与高脂血症诱导ED发生的机制研究

研究表明ED可能由多种因素引起，其中一个重要因素是高脂血症，患有高脂血症的男性比没有高脂血症的男性更容易患有勃起功能障碍（ED），但其机制尚不完全清楚42。Li等43通过构建高脂血症大鼠模型发现，与对照大鼠相比，高脂血症大鼠阴茎海绵体组织中抗凋亡标志物Bcl-2、平滑肌/胶原比率自噬标志和物Beclin1和LC3A / B的表达降低，同时高脂血症大鼠的细胞凋亡指数、纤维化水平和凋亡指标Bax的表达明显增加。由此我们认为，高脂血症可能促进高脂血症大鼠阴茎海绵体细胞凋亡和抑制自噬，这也可能是阴茎海绵体纤维化的重要原因。

2.4自噬参与糖尿病诱导ED发生的机制研究

糖尿病是ED极其重要的危险因素，据统计，糖尿病患者患ED的风险为30%~80%，约为正常人的3倍，而且，患ED的时间较正常人提前约10年，并且症状更加严重，严重影响患者的生活质量44,45。糖尿病导致ED的发病机制很复杂，涉及内分泌、血管、神经等多个系统，Zhang等46证实糖尿病大鼠阴茎海绵体中自噬增强，淫羊藿苷显着增加平滑肌增殖指数和p-p70S6K（Thr389）水平，并减少自噬体数量和LC3-II水平，同时淫羊藿苷降低了糖尿病ED组的AGE浓度并增加了cGMP浓度，NOS活性和cNOS水平，改善大鼠的勃起功能。Liu等47用H2O2处理小鼠C3H10间充质干细胞（MSCs），模拟糖尿病ED的高氧化条件。结果显示，H2O2（300μmol/ L）可诱导细胞凋亡，并激活MSCs中的自噬，用溶酶体抑制剂氯喹（10μmol/ L）或PI3K抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA，5 mmol / L）预处理会有效抑制细胞自噬，同时可显着增强H2O2诱导的细胞死亡。用JNK（MAPKs）抑制剂SP600125（10μmol/ L）预处理可以消除H2O2诱导的LC3-II积累，并减弱H2O2诱导的MSCs中Bcl-2水平的降低。研究者认为虽然ROS通过细胞凋亡杀死MSCs，但它也诱导细胞产生保护性自噬。但由于细胞凋亡势不可挡，自噬不能超越细胞凋亡。 因此，自噬的增加可以减少细胞凋亡并延长移植的MSC存活率，改善基于MSC的糖尿病ED治疗。我们课题组通过腹腔注射链佐菌素建立I型糖尿病诱导ED模型，与正常对照组相比，糖尿病组大鼠阴茎海绵体免疫荧光下的细胞自噬水平有所增强，LC3BII/LC3BI比值和Beclin1蛋白表达有所增加，p62蛋白表达有所下降，提示在糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中细胞自噬水平高于正常大鼠。给予雷帕霉素治疗后，细胞自噬进一步增强，大鼠勃起功能可以部分改善。由此可见，自噬在糖尿病中的作用并不统一，对自噬的调节及其复杂，在不同的机体状态下可以介导不同的生理功能，自噬的系统性激活可能并不总是诱导非靶向健康细胞的有益效应，并且应当在每个靶器官的每个疾病阶段将自噬控制在适当的水平。如何进行界定还需要进一步探讨。

2.5自噬参与缺氧性ED发生的机制研究

缺氧是勃起功能障碍( ED ) 独立的危险因素48。在临床常见的全身性缺氧性疾病及阴茎海绵体局部缺氧模型中49-51，ED 的发生率都远远高于一般人群。缺氧性 ED 患者阴茎海绵体结构改变的主要机制可能是 CCSMC 表型转换导致的阴茎海绵体平滑肌功能失调。平滑肌表型转换是平滑肌细胞从收缩型表型转化为合成表型并获得增殖能力的过程。这种转换打破了收缩型及合成型平滑肌功能的平衡，可能是各类 ED 的共同病理生理学机制，与 ED 的发生密切相关52,53。关于自噬与血管结构改变的研究，早在 1974 年就有学者在高血压大鼠血管中发现自噬可增强血管平滑肌增殖，但导致其增殖机制当时尚未明确。关于血小板源性生长因子 ( platelet-derived growth factor，PDGF) 的研究表明，PDGF 所介导的自噬可促进表型转化54，并且可能因此引起平滑肌增殖。但也有研究表明，自噬诱导剂雷帕霉素所诱导的自噬有维持 VSMCs 收缩型表型的作用55，说明自噬与VSMCs 表型转化呈负性相关。所以自噬对于表型转化及缺氧性勃起功能的影响尚有争议存在，其机制有待进一步探讨，可能与诱导条件不同有关。

3、小结

自噬普遍存在于真核细胞中，作用于正常及病理过程中的细胞。近年来由于分子学、基因 学等实验手段的日趋完善，自噬的研究取得了长足发展，但对自噬膜的起源、信号转导、调节机制及其对细胞影响等方面的研究尚不全面，其在ED意义尚未明确，参与机制尚未完全了解。通过自噬来影响疾病的进程在科研和临床上还尚需进一步研究，自噬的分子生物学机制及相关通路的深入研究必将为人类对抗和治疗相关疾病产生深远影响。

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